Western blot

Western Blot

Principe

Le Western Blot est une technique permettant d’identifier des protéines grâce à leur poids moléculaire. Cette technique se déroule en 4 étapes :

Dénaturation

• Cette première étape va permettre de dissocier les protéines en sous unités et de leur conférer une charge négative, afin qu’elles puissent migrer dans le gel, grâce à un agent dénaturant appelé le SDS.

Electrophorèse

• La deuxième étape est l’électrophorèse des protéines sur un gel de polyacrylamide. C’est lors de cette étapes que les protéines vont migrées dans le gel grâce au courant électrique généré par un générateur.

Transfert

• La troisième étape est le transfert des protéines migrées sur une membrane de nitrocellulose, grâce à un courant électrique, mais tout en gardant leur précédente organisation. Ce transfert nécessite un tampon de transfert qui permet de faire migrer les protéines sur la membrane.

Révélation

• La dernière étape est celle de la révélation, il y a 4 révélation possible :

Révélation par fluorométrie, colorimétrie, radioactivité , chimiluminescence . La révélation par colorimétrie du western blot est basée sur l’action d’anticorps afin d’obtenir un produit coloré qui sera utilisé pour visualiser les protéines recherchées. Cela se déroule en plusieurs étapes : Un anticorps primaire va se lier spécifiquement à la protéine cible et former un complexe. Un anticorps secondaire couplé à une enzyme (ex: HRP) va se fixer à l'anticorps primaire. En réagissant avec son substrast, l'enzyme va produire un produit chromogène. Il est donc possible de visualiser les protéines sous forme de bandes et de déterminer leur poids moléculaire grâce à des marqueurs de poids moléculaire. NB : Des lavages entre chaque étape de la révélation est nécessaire pour éliminer le surplus d’anticorps non fixé qui pourrait fausser les résultats.

substrat

enzyme

Avantages :- Pas besoin de matériel particulier - Méthode simple et linéaire Inconvénients :- Sensibilité limitée - Les membranes de transferts ne peuvent pas être nettoyés et réutilisés pour des cibles supplémentaires - Méthode indirecte ce qui peut parfois rendre difficile la lecture des résultats

AcII

produit chromogène

AcI

protéine

Schéma d’une révélation par colorimétrie pour la méthode Western Blot

Anaëlle SCRIBE et Manon THOUVARD groupe A1