Detección gen GFP por PCR

Laboratorio de Biotecnología de plantas

Segundo semestre 2020-2021

Detección del gen GFP por medio de PCR en plantas GM

Objetivos

- Entender el principio del uso de la técnica de PCR para detección de plantas genéticamente modificadas - Realizar un PCR en un simulador virtual y determinar eficiencias de reacción

Transformación genética

• Insertar genes adicionales al de interés
• Marcadores de selección
• Genes reporteros

Transformación genética

• Marcador de selección
• Gen que confiere resistencia a alguna sustancia letal para la célula o tejido hospedador, o alguna ventaja adapta:va sobre las células que no lo incorporaron.

Transformación genética

• Gen reportero
• Gen cuyo producto es fácilmente detectable. Se lo usa en construcciones gené9cas para verificar la transferencia del transgén a una célula o tejido, o para estudiar la actividad de promotores y otras secuencias reguladoras

Plásmido pGWB402

• Marcador de selección el gen nptII y como gen reportero al gen GFP
• El gen nptII posee resistencia a kanamicina, un antibiótico del grupo de los aminoglucósidos que interfiere con el proceso celular de traducción. El gen GFP codifica para la proteína verde fluorescente.

Basado en ADN: PCR Cualitativo

Basado en proteínas: Varillas de flujo laterales

Técnicas para detectar plantas GM

Basado en ADN: PCR Cuantitativo

Caracterización fenotípica: ensayos con herbicidas

Basado en proteínas: ELISA

PCR cualitativo

• Técnica que permite amplificar o copiar varias veces un fragmento específico de ADN
• Se escoge una región en particular del genoma y se amplifica
• Así se purifica y separa del resto del genoma
• Necesario tener primers específicos correspondientes a secuencias flanqueantes al gen de interés
• Sólo permite detectar la presencia o ausencia del gen, mas no la cantidad del mismo

PCR cuantitativo

• Variante de PCR convencional (cualitativo) que permite amplificar y simultáneamente cuantificar el producto de la amplificación
• Sustancia marcada con un fluoróforo y termociclador provisto de sensores de fluorescencia
• La cantidad de producto sintetizado durante la PCR se estima directamente mediante la medición de la fluorescencia en la reacción de PCR.

Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)

• Se basa en la unión de un anticuerpo a un antígeno (proteína de interés)
• Fase sólida (placas de microtitulación)
• El antígeno y el anticuerpo reaccionan y producen un complejo estable, que puede visualizarse mediante la adición de un segundo anticuerpo unido a una enzima.
• La adición de un sustrato para esa enzima formación de color

Varillas de flujo laterales

• Utiliza un sistema de detección basado en membrana
• La membrana contiene dos zonas de captura, una captura la proteína transgénica y la otra captura el reactivo de color.
• La tira se sumerge en la muestra preparada en la solución de extracción y la muestra migra hacia arriba por la tira por acción capilar.

Ensayos con herbicidas

• La caracterización fenotípica permite detectar la presencia o ausencia de un rasgo específico.
• Pruebas de germinación en medios de germinación sólidos en presencia de un herbicida específico, donde las semillas no transgénicas y transgénicas presentan características diferenciadas.
• El nivel de detección depende de la germinación de la semilla
• Las semillas que resulten positivas deben exponerse a pruebas posteriores para su confirmación.

Comparación métodos

PCR Práctica

PCR Práctica