Le séquençage de l'ADN

Le séquençage de l'ADN

Comment détermine-t-on la séquence de nucléotides d'un brin d'ADN ?

Qu'est-ce que le séquençage de l'ADN ?

L'ADN est constitué d'une succession de nucléotides. Séquencer l'ADN est donc trouver la séquence des nucléotides du fragment étudié. Le séquençage est l'action de séquencer. Attention à ne pas confondre le séquençage (action) et la séquence obtenue (résultat)

Une vidéo introductive de l'INSERM (Institut national de recherche médicale)

La méthode de Sanger

Etapes du protocole

1. Fragmentation du brin à séquencer

Le séquençage se fait sur de courtes portions de l'ADN. On commence donc par le copier un grand nombre de fois et on le découpe aléatoirement. Pour reconstituer la séquence totale on utilise les bouts répétés.

Pour comprendre cela, écrivez sur ue feuille de brouillon une séquence. Faites en une copie et découper les deux séquences en morceaux de taille différentes. En superposant les parties répétées vous pouvez remettre les morceaux dans l'ordre.

2. Séquençage des portions

Sanger met dans 4 tubes tout ce qu'il faut pour REPLIQUER l'ADN : nucléotides, ARN polymérase, l'ADN à séquencer... Il ajoute dans chaque tube un nucléotide particulier (ddA, ddT, ddC ou ddG). Ces nucléotides ont une base azotée normale donc peuevent être intégrés par complémentarité des bases mais ils ne peuvent se lier que d'un côté Ainsi quand ils sont mis dans la chaine, la réplication s'arrête.

2. Séquençage des portions

Le nucléotide modifié n'est pas intégré à chaque fois puisqu'on a également introduit des nucléotides normaux. Dans le tube avec du ddT on obtient donc des portions d'ADN de taille différentes car la réplication a pu s'arêter aux différents endroits où on trouve un A dans la séquence (le T mis par coplémentarité des bases peut être le ddT et donc avoir arrêté la rélication)

Pour comprendre, écrivez une portion d'ADN de 12 NT. Ecrivez tous les brins répliqués que l'on peut obtenir en présence de ddT, puis avec les autres nucléotides midifiés.

Brins obtenus en présence de ddT

• Exemple :
• ADN de départ : ATTCGATGAATA
• En présence de ddT :
• ddT
• TAAGCddT
• TAAGCTACddT
• TAAGCTACTddT
• TAAGCTACTTAddT

• A vous de faire avec les autres ddNT puis à partir d'un autre brin initial.

3. Séparation des fragments obtenus

Il réalise ensuite une électrophorèse des fragments obtenus dans les 4 tubes pour les séparer selon leur masse. 1. Rappeler le principe de l'électrophorèse. 2. Parmi les fragments dessinés pour chaque tube dans l'étape précédente, lequel migre le plus loin.

3. Séparation des fragments obtenus

Voici un exemple de résultat. Pour le lire il faut partir du fragment le plus petit car il correspond à une réplication stoppée au premier nucléotide. On peut ensuite lire les NT en premant les fragments pa taille croissante et en sachant quel NT les a arrété (en fonction du tube dans lequel ils se trouvent)

Lisez le brin d'ADN formé. Pour avoir le brin d'ADN de départ il faut encore prendre le complémentaire puisque les fragments qui migrent sont des copies obtenues par complémentarité du brin de départ.

Test final : Rentrez la séquence du brin qu a donné l'électrophorèse précédente.

Vidéo récapitulant les étapes pour vous aider

Enjeux éthiques liés au séquençages

Quels sont les enjeux éthiques liés au développement du séquençage ? A l'aide de la vidéo de l'INSERM et de votre réflexion personnelle, identifiez les principales questions que souèvent la mise au point de techniques performantes de séquençage.

THANKS!

séquence caquée