3. Lab. Parasitología (Métodos de frotis sanguíneo)

Laboratorio Parasitología

Maria Leticia García Gómez Noviembre 2021

Índice

PARASITOS DE LA SANGRE Y LOS TEJIDOS.

Titulo

Fresco

Material

Metodología

Metodología

Introducción

Comparacion sangre y tejidos

Interpretacion

T. Giemsa

Dx. Malaria

Gracias

Trypanosoma crzui

DIAGNOSTICO DE PARASITOS DE LA SANGRE Y LOS TEJIDOS.

Introducción

Los parásitos se discuten usualmente en forma separada de los que habitan en el tracto gastrointestinal. Sin embargo, se debe entender que los parásitos de la sangre y los tejidos, incluyendo nematodos, cestodos y flagelados, son morfológicamente similares a sus contrapartes intestinales; así por ejemplo, plasmodios responsables de la malaria son esporozoarios que tienen también una contraparte intestinal, la Isospora hominis, que se pueden hallar en las heces; pero se piensa que no causa enfermedad primaria en seres humanos.

En general, los ciclos vitales de los parásitos de la sangre y los tejidos son más complejos que los de sus contrapartes intestinales. La mayoría de los parásitos de la sangre involucran un vector artrópodo, así como también un huésped humano, en tanto que muchos de los parásitos que causan infecciones titulares utilizan diversos insectos para desarrollar los estadios intermedios de sus ciclos vitales. Los parásitos que infectan la sangre pueden hallarse intracelularmente, en los eritrocitos o extracelularmente en el plasma. Los grandes organismos extracelulares, como las microfilarias y los tripanosomas pueden verse por examen microscopio directo de frotis de sangre sin teñir. Las formas parasitarias intracelulares más pequeñas requieren un frotis teñido, a fin de visualizar sus estructuras internas.

PARÁSITO DE LA SANGRE

B. EXTRACELULARES 1. Microfilarias: Wuchereria bancrofti Brugia Malawi Loa loa Mansonella ozzardi 2. Protozoos: Tripanosoma cruzi Tripanosoma gambiense Tripanosoma rhodesiense.

vs

A. INTRACELULARES Plasmodium spp Babesia spp

PARÁSITO DE LOS TEJIDOS

A. INTRACELULARES

B. ESTRACELULARES

1. Cutaneos: Leishmania tropica Leishmania braziliensis 2. Visceral: Leishmania donovani Toxoplasma gondii Tripanosoma cruzi

1. Cutaneos: Onchocerca volvulus 2. Visceral: Trichinella spiralis Echinococcus granulosus Cysticercus cellulosae Toxocara spp Pneumocystis carinii

vs

01 DIAGNOSTICO DE MALARIA

El diagnóstico se establece mediante la demostración de los plasmodios en la sangre; lo cual se logra realizando un frotis de sangre bajo la técnica de gota gruesa obtenida momentos antes del acceso febril. Este método permite la identificación morfológica de las fases evolutivas del ciclo eritrocitos y la identificación entre las especies de Plasmodium.

En forma indirecta se puede investigar la presencia de Plasmodium en un paciente, mediante reacciones serológicas como: inmunofluorescencia indirecta, hemaglutinación indirecta, ELISA y radioinmunoensayo.

Material

• Ratón CD1 infectado con Plasmodium yoelli. • Soporte, charola de tinción para portaobjetos • Colorante Giemsa en frasco gotero • Metanol en frasco gotero • Microscopio, portaobjetos y papel seda • Aceite de inmersión • Preparaciones fijas de: Plasmodium vivax, Plasmodium malarie y plasmodium falciparum.

Metodología

SE DEBERÁN USAR GUANTES DE CIRUGÍA AL MOMENTO DE TOMAR LAS MUESTRAS DE SANGRE PARA HACER LOS FROTIS.

2. En otro portaobjetos, colocar una gotita de sangre y usando la esquina de un portaobjetos, extenderla con movimiento rotatorio, a manera de formar una pequeña área de aproximadamente 1 cm. De diámetro: gota gruesa.

1. En un portaobjetos hacer un frotis (preparación ó extensión fina) con sangre de la cola de un ratón inoculado con plasmodium.

3. Colocar el frotis (extensión fina) ligeramente inclinado y dejar escurrir metanol.

4. El portaobjetos con la muestra en gota gruesa se lava con agua.

+ Manual UAEM

Metodología

SE DEBERÁN USAR GUANTES DE CIRUGÍA AL MOMENTO DE TOMAR LAS MUESTRAS DE SANGRE PARA HACER LOS FROTIS.

7. Verter suavemente el colorante sobre el portaobjetos usado para ello una pipeta o un gotero. Otra posibilidad es colocar los portaobjetos hacia abajo en un disco de tinción cóncavo e introducirlo con pipeta Pasteur el colorante por debajo del portaobjetos.

6. Preparar una solución de Giemsa al 10 % en agua amortiguada, destilada o desionizada, de pH 7.2 si se necesita poca cantidad, 3 gotas de colorante por un ml de agua amortiguada bastarán para conseguir la concentración correcta de solución de Giemsa.

5. Dejar secar al aire ambos portaobjetos.

Metodología

Paso 9

Paso 10

Paso 11

Paso 8

Dejar actuar el colorante de 5 a 10 minutos.

Eliminar suavemente el colorante del portaobjetos añadiendo agua limpia gota a gota sin inclinarlo ya que así quedaré un depósito de espuma sobre la preparación.

Observar al microscopio con objetivo de 100x e identificar los estadios de trofozoitos, esquizontes y gametocitos.

Colocar el portaobjetos en la gradilla o soporte, con la cara de la extensión hacia abajo, para que escurra y se seque, asegurándose de que la extensión no toque el soporte.

INTERPRETACIÓN

Cuando se examinan al microscopio los frotis sanguíneos finos, debe prestarse atención a los eritrocitos y a los parásitos que hay dentro de ellos; prestar especial atención a la presencia del punteado o moteado de Schuffner, ya que es un signo diferencial para Plasmodium vivax.

En el examen microscópico de las preparaciones teñidas con gota gruesa, los eritrocitos quedan lisados, de modo que el diagnóstico se basa en el aspecto del parásito, los cuales sueles ser más compactos y densos que en las extensiones finas.

El aspecto que deben presentar las preparaciones es el siguiente: • El fondo debe estar limpio, exento de residuos con un color gris pálido moteado debido a la lisis de los eritrocitos. • Los núcleos de los leucocitos estarán teñidos de morado fuerte y vivo. • Los parásitos palúdicos están bien definidos, presentan la cromatina de color rojo oscuro y el citoplasma de color azul violáceo claro.

Nombre del autor/a

Observación al Microscopio con objetivo 100 X con aceite de inmersión

Huésped vertebrado ciclo preeritrocítico inoculación de esporozoítos migración a hígado invasión de hepatocitos multiplicación esquizonte criptozoico ruptura celular liberación de merozoítos de primera generación ciclo paraeritrocítico o exoeritrocítico invasión de merozoítos a células hepáticas multiplicación ruptura celular liberación de merozoítos ciclo eritrocítico invasión de merozoítos a eritrocitos Trofozoíto joven trofozoíto maduro esquizonte joven esquizonte maduro ruptura celular merozoítos libres invasión a nuevos eritrocitos ciclo sexual en algunos eritrocitos parasitados. microgametocítico macrogametocítico Huésped invertebrado ciclo esporogónico picadura del anofelino succión de células parsitadas o parasitos libres gametocitos en estómago macrogametocito madura a macrogameto microgametocito exflagelación microgametos móviles fecundación cigoto oocineto atraviesa la pared digestiva ooquiste en capa serosa formación de esporozoítos picadura del anofelino inoculación de esporozoítos

02 DIAGNOSTICO DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS: TRIPANOSOMIASIS AMERICANA

Introducción

La enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana es causada por el flagelado Tripanosoma cruzi, que generalmente es transmitido al humano por las heces de un artrópodo: Triatoma sp (triatominos). El parásito en el humano, ataca células del sistema reticuloendotelial, particularmente a las del miocardio, esófago o colon.

El examen de sangre es la prueba clásica para la detección de tripomastigotes, el cual consiste del examen directo y el frotis fino o grueso teñido con Giemsa. También es recomendable hacer técnicas de concentración de sangre mediante los métodos de Stronto Woo (en hematocrito). Además hay pruebas inmunológicas que de manera indirecta apoyan al diagnóstico durante la fase crónica y son útiles en estudios epidemiológicos. Las más usadas son: inmunofluorescencia indirecta, hemaglutinación indirecta, contrainmunoelectroforesis, doble difusión y ELISA.

El xenodiagnóstico es el único diagnostico útil para detectar el parásito durante la Fase crónica de la enfermedad. Se basa en la multiplicación del Tripanosoma cruzi en el tubo digestivo de triatominos y el examen posterior de sus heces, durante uno a tres meses.

• Ejemplares de Tiatoma sp •Ratón infectado con T. cruzi • Suero fisiológico en frasco gotero • Pipeta Pasteur estériles • Portaobjetos, cubreobjetos • Guantes y cubrebocas • Preparaciones fijas de T. cruzi • Microscopio y aceite de inmersión • Metanol en un frasco gotero.

Material

01 EXAMEN DE SANGRE DIRECTO O EN FRESCO

Este método constituye la forma más fácil y barata de revelar la presencia de parásitos en la sangre, pero es la prueba menos sensible.

Metodología

SE DEBERÁN USAR GUANTES DE CIRUGÍA AL MOMENTO DE TOMAR LAS MUESTRAS DE SANGRE Y AL HACER LOS FROTIS.

3. Añadir una gota de igual tamaño de solución salina fisiológica Mezclar la sangre y la solución utilizando una esquina de un cubreobjetos y cubrir con éste la preparación.

1. Cortar con unas tijeras un fragmento de a porción distal de la cola de un ratón inoculado con T. cruzi

4. Examinar a preparación fresca sistemáticamente al microscopio con objetivo de 10x con poca abertura del diafragma. El primer signo de la presencia de Tripanosomas vivos es un movimiento rápido entre los glóbulos rojos.

2. Recoger la primera gota de sangre que aparezca, directamente en el centro de un portaobjeto.

02 PREPARACION FINA Y DE GOTA GRUESA CON TINCION DE GIEMSA.

Trypanosoma cruzi

Metodología

Este método es más sensible que la extensión húmeda porque se observa más cantidad de sangre por campo.

1. Colocar el frotis fino ligeramente inclinado y dejar escurrir sobre él un poco de metanol.

2. El frotis de gota gruesa se deberá lavar con agua dejando escurrir ésta suavemente sobre el frotis ligeramente inclinado.

4. Colocar ambas preparaciones en posición invertida e inclinada en una charolita de tinción y agregar con una pipeta Pasteur el colorante de Giemsa, teniendo cuidado de que el colorante esté en contacto con la parte que contiene la sangre, es decir con la parte posterior del portaobjetos, no sobre la cara anterior.

3. Dejar secar al aire ambos frotis

Metodología

Paso 7

Paso 8

Paso 5

Paso 6

Dejar secar al aire ambos portaobjetos.

Observar a microscopio con el objeto 100x e identificar los tripomastigotes de Tripanosoma cruzi en los dos frotis.

Retirar los portas de la charolita y ligeramente inclinados, lavarlos suavemente con agua por tiempo breve.

5. Dejar actuar el colorante durante 30 min, agitando dos veces la gota gruesa para remover la hemoglobina.

Huésped vertebrado penetración de tripomastigotes metacíclicos fagocitosis transformación a amastigotes multiplicación por fisión binaria ruptura celular liberación de formas parasitarias transformación a tripomastigotes sanguíneos penetración a otras células y tejidos

Huésped vertebrado penetración de tripomastigotes metacíclicos fagocitosis transformación a amastigotes multiplicación por fisión binaria ruptura celular liberación de formas parasitarias transformación a tripomastigotes sanguíneos penetración a otras células y tejidos Huésped invertebrado picadura de triatominio succión de formas parasitarias tubo digestivo transformación a epimastigote multiplicación por fisión binaria migración a intestino posterior transformación a tripomastigotes metacíclicos eliminación de tripomastigotes en las deyecciones

1) KONEMAN; ALLEN; DOWELL; SOMMERS. Diagnóstico microbiológico; Editorial Médica Panamericana; México, 1991. 2) DE LA CRUZ OTERO, CARMEN; et al. Prácticas de Parasitología; México, 1992. 3) SALAZAR DE HARO Manual de técnicas para el diagnóstico morfológico de las parasitosis; Editorial Francisco Méndez; México, 1980. 4) OMS: Laboratorio de Parasitología; Organización Mundial de la Salud; 1990.

¡Muchas gracias!