Exercices de biochimie analytique I 2021-2022

Travaux dirigés de BIochimie AnalYtIQUE I

Licence Sciences de la vie Molécules et Cellules (Bloc C) Semestre 5

H. Dumay-Odelot & Jérôme Joubès

Vous trouverez dans les pages suivantes une série d'exercices afin d'approfondir le cours de méthodologie en biochimie analytique à réaliser:

EN PRESENTIEL

01

EN AUTONOMIE

02

START

START

ANNALES D'EXAMENS

04

Auto-EVALUATION (TEST moodle)

03

START

START

EN PRESENTIEL

Séance de TD n°1 : -Analyses électrophorétiques de CFTR responsable de la mucoviscidose -Analyse de la lactate deshydrogénase LDH par électrophorèse native -Analyse de l'hexokinase par électrophorèse bidimensionnelle -Exercice suppl: électrophorèse capillaire

Séance de TD n°2 : - Purification de la toxine botulique ou botox - Recherche de pesticides par CPG

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TD n°2

TD n°1

TD n°1: EXERCICE N°1: Analyseélectrophorétique de CFTR responsable de la mucoviscidose

La mucoviscidose est une maladie qui affecte la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator). Elle constitue un canal ionique dans la membrane plasmique des cellules épithéliales responsable de la production du mucus intestinal et respiratoire. On veut examiner plusieurs patients atteints de cette maladie afin d’identifier le défaut responsable d’un disfonctionnement de la protéine CFTR.

Info

On dispose pour chacun de ces patients des prélèvements de cellules épithéliales respiratoires dont on veut purifier les acides nucléiques totaux (ADN et ARN) afin d’examiner le gène codant pour la protéine CFTR. Au laboratoire d’analyse le préparateur dispose de plusieurs solutions pour effectuer cette purification : -Solution A : phénol/chloroforme pH8 -Solution B : phénol/chloroforme pH5 -Solution C : Ethanol, NaCl 3M -Solution D : Tris HCl 20 mM pH 8, SDS 10% - Solution E : Tris HCl 20 mM pH 8, SDS 10%, DNase -Solution F : Tris HCl 20 mM pH5 + glycérol Q1-Quelles sont les trois étapes principales d’une purification d’acides nucléiques totaux ? Q2-Trois de ces tampons seront utilisés pour cette purification. Donner l’ordre de leur utilisation et leur rôle. Q3-Comment vérifier la qualité de la purification ?

Une purification d’ARN est ensuite faite à partir de chacune des préparations d’acides nucléiques des patients (A, B, C, D) et de celle d’un contrôle sain (cont). Q4-Comment purifier les ARN à partir d’une préparation d’acides nucléiques ? Auriez-vous pu purifier les ARN directement à partir des cellules épithéliales. Expliquer le principe. Q3-Comment obtenir ensuite des ARN messagers ?

On dispose d’échantillons d’ARNm issus de patients atteints de mucoviscidose A, B, C, D et d’un individu sain (CONT). A partir de ces échantillons, une électrophorèse sur gel d’agarose est effectuée suivie d’un transfert sur membrane. Après une étape de dénaturation des ADN sur la membrane, deux sondes d’ADN radioactives sont successivement utilisées pour repérer l’ARNm codant pour la protéine CFTR et l’ARNm codant pour la protéine actine (protéine exprimée constitutivement). Le schéma du northern blot obtenu est présenté ci-dessous.

Figure 1 : Northern blot à partir des ARN messagers de 4 patients atteints de mucoviscidose (patients A, B, C, D) et d’une personne saine (cont). Les cibles des sondes d’hybridation sont indiquées sur la figure.

Q5-Dans cette expérience à quoi sert la sonde actine ? -Interprétez les résultats obtenus dans ce northern en justifiant votre réponse ?

Le cas du patient A a retenu ensuite l’attention des chercheurs. Après séquençage du gène CFTR de 250 000 paires de bases, une délétion des nucléotides 1653 à 1655 entraine la délétion d’un acide aminé : la phénylalanine en position 508 (mutant delta F508). Cette mutation suffit à inhiber l’activité du récepteur. Afin de mieux comprendre l’impact de cette mutation, des cellules épithéliales d’une personne contrôle et du patient A ont été utilisées pour préparer un extrait protéique clarifié (respectivement extrait CFTR WT et CFTRdeltaF508).

Q6-Proposez un protocole de préparation des extraits protéiques clarifiés en précisant les composés et conditions essentiels à ajouter au tampon de lyse des cellules.

A partir de ces extraits CFTR WT et CFTR deltaF508, une électrophorèse SDS-Page a été effectuée suivie d’un western blot avec les anticorps dirigés contre les protéines CFTR et l’actine.

Figure 2 : Western blot à partir d’extraits protéiques CFTR WT et CFTRdeltaF508. Les extraits des puits 2 et 4 ont été incubés avec la PNGase F (une N-glycosidase qui clive les oligosaccharides liés aux glycoprotéines par une liaison N-glycosidique).

Q7-Sachant que le gène CFTR code pour 1 480 aa et que le poids moléculaire moyen d’un acide aminé est de 110 Da, analyser la figure 2.

TD n°1: EXERCICE N°2: Analyse de la lactate deshydrogénase LDH par électrophorèse native

On retrouve la LDH dans les cellules de différents organes et tissus : rein, cœur, muscles, pancréas, rate, foie, cerveau, poumons, peau, globules rouges, placenta .... En cas de maladie ou de lésion qui endommage les cellules, des LDH sont libérées dans le flux sanguin. L’ analyse de la LDH a été effectuée par électrophorèse sur gel natif d’acrylamide. La révélation des LDH a été effectuée par immunodétection sur membrane (ou western blot).

Le profil de gel obtenu est le suivant :A- échantillon provenant du muscle cardiaque B- échantillon provenant du foie C- échantillon provenant du muscle squelettique

Q1- En vous référant au principe de séparation des protéines par ce type d’électrophorèse et sachant que lors d’une purification par gel d’exclusion ces différents échantillons ne présentent qu’un seul pic d’élution pour la LDH, analysez ces profils de gel.

Lors d’une attaque cardiaque, le muscle cardiaque est endommagé et le contenu des cellules est relâché dans le réseau sanguin 12 à 24 h après l’attaque. Une électrophorèse du sérum montre alors une augmentation de la forme LDH-H4. On peut ainsi diagnostiquer un infarctus du myocarde. Q2- L’électrophorèse a été effectuée dans un tampon pH 8,4 ; le pHi des isoenzymes de la LDH est inférieur à 8 et la LDH-H4 est l’isoenzyme qui a le pHi le plus faible. A partir de ces données schématisez le sens de migration du gel et le positionnement de l’isoenzyme LDH-H4 par rapport aux autres formes de la LDH (justifiez votre réponse).

Le profil de gel obtenu est le suivant :A- échantillon provenant du muscle cardiaque B- échantillon provenant du foie C- échantillon provenant du muscle squelettique

TD n°1: Exercice 3: Caractérisation de l'héxokinase par électrophorèse 2D

Afin de caractériser l’hexokinase, des foies de rats sont prélevés, homogénéisés en extrait protéique puis soumis à une centrifugation à forte vitesse pendant une heure à 4°C. La fraction soluble, contenant l'enzyme, est analysée par électrophorèse bidimensionnelle. Ainsi la séparation des protéines a lieu en deux temps: -tout d’abord grâce à une électrophorèse IEF (électrofocalisation) -puis par électrophorèse SDS-PAGE. Le profil électrophorétique après révélation des protéines vous est présenté dans la figure ci-contre. Le gel obtenu est ensuite transféré sur membrane pour être révélé par immunomarquage (western blot) en utilisant un anticorps polyclonal spécifique de l’hexokinase. Les spots 1 et 2 indiquent les spots reconnus par un anticorps spécifique de l’hexokinase.

Q1-D'après les principes de ces deux électrophorèses, définir les critères de séparation des protéines dans chacun des cas.

Q2-D'après les résultats de l'immunomarquage, que peut-on déduire sur la protéine hexokinase de foie de rat ?

Des analyses complémentaires montrent qu'il existe quatre isoenzymes d'hexokinase dont la distribution intracellulaire et la cinétique varient en fonction des substrats et des conditions physiologiques. Les hexokinases I, II, III ont une masse moléculaire de 100 kDa, l'hexokinase IV a une masse moléculaire de 50 kDa. Q3- Que déduire de la structure de ces isoenzymes ?

TD n°1: EXERCICE n°4: Electrophorèse capillaire

En biologie clinique, l’électrophorèse capillaire est souvent utilisée pour l’examen des protéines sériques afin de dépister de nombreuses pathologies notamment des syndromes inflammatoires. On considère une installation d’électrophorèse capillaire comportant un capillaire de verre dont les parois internes en silice fondue, portent une couche chargée négativement.Q1-Citer les deux phénomènes à la base de la séparation des molécules par électrophorèse capillaire ?Le schéma de principe de cette électrophorèse capillaire est reproduit ci-dessous. Le schéma de principe de cette électrophorèse capillaire est reproduit ci-dessous.

Q2-Compléter ce schéma en indiquant la cathode, l’anode, le capillaire, le détecteur, la source de haute tension et le sens de migration. Justifier votre réponse en expliquant le flux électro-osmotique.

TD n°1: EXERCICE n°4: Electrophorèse capillaire

Q3-Définir les notions de mobilité apparente μ app, de mobilité électro-osmotique μeo et de mobilité électrophorétique μe. Donner la relation existante entre ces trois mobilités en citant les facteurs influençant la mobilité électrophorétique et électro-osmotique d’une espèce chargée. L’analyse de globulines a été effectuée à partir du sérum d’un patient. La séparation de trois espèces de globuline vous est présentée ci-dessous. Ces espèces sont : alpha1-globuline (pHi 5,2), béta-globuline (pHi=5,6), gamma-globuline (pHi 6). Sur le graphe est indiqué le temps de migration de chaque espèce en seconde et la migration de l’espèce neutre.

Q4-Sachant que l’électrolyte utilisé à un pH de 5,6 ; indiquez à quel pic correspond chacune des globulines. Justifiez votre réponse Q5- Que se passerait-il si on utilisait un capillaire à paroi traitée pour le rendre neutre ? Est-ce judicieux dans le cas présent ?

TD n°2: EXERCICE N°1: Purification de la toxine botulique ou botox

La toxine botulique de type A (BoNTA) ou Botox® est une protéine utilisée dans le traitement de maladies neurologiques comportant une trop grande activité musculaire (contractions et mouvements anormaux, crampes, spasticité, dystonie). Elle est aussi employée en cosmétique, par exemple pour réduire les rides faciales ou la transpiration excessive. Il est possible de purifier cette protéine à partir d’une culture de bactéries Clostridium botulinum. Les bactéries sont lysées puis le mélange est soumis à une centrifugation à forte vitesse pendant une heure à 4°C.

La toxine Botox possède une activité protéase. A partir du lysat obtenu, on effectue une purification de la protéine d’intérêt en 2 étapes chromatographiques successives : -une chromatographie d’affinité -suivie d’une chromatographie échangeuse d’ions.

1-La première étape de purification du Botox est une chromatographie d’affinité. Q1- Donner le principe général de cette technique chromatographique.

+ d'infos sur le botox

La toxine Botox a la possibilité d’être complexée de façon non covalente à une protéines contaminante dans le lysat : l’hémagglutinine. Il existe un inhibiteur irréversible de l’hémagglutinine. Ce ligand spécifique a la particularité de se lier de façon très stable à l’hémagglutinine.

Q2- Sachant que ce ligand a été utilisé pour purifier la toxine Botox à partir du complexe Botox-hémagglutinine et en vous appuyant sur le chromatogramme correspondant à cette première étape de purification (figure 1), détaillez le protocole de la chromatographie d’affinité utilisée.

2 - La deuxième étape de purification est une chromatographie échangeuse d’ions sur colonne DEAE-Sephadex. Les groupements actifs DEAE (DiéthylAminoEthyl) sont chargés positivement lorsque le PH du milieu est inférieur au pKA de la colonne (8,5). Avant le dépôt des protéines, la résine est équilibrée dans le tampon phosphate 0,1 M pH 7,9.

Q3- Quel est le principe général d’une chromatographie échangeuse d’ions ? Définir les différentes étapes de ce type de purification. Quel est l’intérêt d’équilibrer la colonne ? Q4- D’après le profil d’élution (Figure 2), comment a été éluée la protéine Botox Q5- A quoi correspondent les deux pics du chromatogramme ? (Justifiez votre réponse). Que pouvez-vous déduire sur le pHi de la protéine ?

3 - Le pic d’élution de cette protéine est ensuite analysé par SDS-Page en présence de béta-mercaptoéthanol ou non (Figure 3). Q6-Analyser le profil électrophorétique. Vous préciserez le rôle du béta-mercaptoéthanol. -Sachant que le Botox natif a une masse molaire de 150 kDa. Que pouvez-déduire sur la structure de cette protéine ?

Figure 3 : SDS-Page coloré au bleu de coomassie du Botox purifié. MW : marqueur de poids moléculaire. 1 : élution sans béta-mercaptoéthanol. 2 : élution avec béta-mercaptoéthanol

On se propose ensuite de doser le Botox purifié par HPLC. L’HPLC a été réalisée par SEC (Chromatographie par exclusion de taille) sur la fraction issue de la chromatographie échangeuse d'ions (Figure 4). La phase mobile utilisée est un tampon phosphate de sodium 100 mM (pH 6,5). Le débit est de 1 ml/min pendant 30 minutes.Q7-Donnez le principe de la chromatographie par exclusion de taille (SEC) et expliquez le résultat obtenu sur le chromatogramme joint dans la figure 4. Quelle est la pureté de la protéine à l'issue de cette chromatographie.

Figure 4: Chromatogramme HPLC de la fraction d’élution du Botox issue de la chromatographie d’échangeuse d’ions

La méthode de dosage du Botox utilise un étalon externe (Tableau 1).

Q8- Expliquez la méthodologie. -A partir des données de la figure 4 et du tableau 1, calculer la concentration en Botox purifié en µg/mL

Tableau 1 : Etalon externe du Botox utilisé en HPLC

Figure 4: Chromatogramme HPLC de la fraction d’élution du Botox issue de la chromatographie d’échangeuse d’ions

Q9- Sachant que le volume d'extrait purifié est de 10 mL et à partir des données supplémentaires du tableau 2, calculer le facteur de purification et le rendement de la purification. Vous préciserez les calculs effectués et interpréterez les résultats obtenus. Tableau 2 :

TD n°2: Exercice n°2 : Recherche de pesticides par CPG

La pollution de l'eau par les rejets de l'agriculture est un problème important. Les pesticides peuvent être dosés à tous les stades de la chaîne alimentaire dans divers produits (eau, poisson, légumes...) par chromatographie en phase gazeuse. La norme CE de 1980 donne les doses maximums prescrites pour l'eau de consommation: (<0,5 µg de pesticides par litre d'eau). Un laboratoire est chargé d’analyser un échantillon d’eau de rivière susceptible de contenir ces contaminants. Les pesticides sont extraits à partir d'1 litre d'eau puis sont séparés et analysés sur une colonne de chromatographie en phase gazeuse dans les conditions indiquées ci contre. En parallèle, un témoin contenant un mélange de pesticides est injecté afin d'identifier par la suite les molécules présentes dans l'échantillon d'eau.

Conditions de chromatographieColonne polaire : DB-35ms - 30m x 0.32mm x 0.25µm Gaz vecteur : hélium à 45cm/s Four : 110°C pendant 0.5 min; 110 à 320°C à 15°C/min; 320°C pendant 2min Injection : sans division, 250°C Détecteur à ionisation de flamme Témoin : 50 pg par composé témoin

Identifier les quatre molécules (A, B, C et D) détectées dans l'échantillon d'eau à partir des deux chromatogrammes fournis. Justifier votre réponse.

La méthode de dosage de ces composés utilise des étalons de calibration externes pour chaque classe de composés (cf tableau 1). Quelle est la méthodologie de l'étalonnage externe et quel est son principal inconvénient? Vous préciserez également pourquoi il est indispensable de réaliser une gamme d'étalonnage pour chaque classe de composés à analyser? A partir des données des tableaux 1 et 2, vous calculerez la concentration de chacun des composés (A, B, C et D) dans l'échantillon en µg.L-1. Vous préciserez par la suite si l'eau du prélèvement est contaminée ou non.

EN AUTONOMIE

EXERCICE N°1: Analyse de la Lactate déshydrogénase (LDH) par chromatographie d'exclusion

EXERCICE N°2: Etude du facteur du récepteur de insuline par SDS-PAGE

EXERCICE N°3: Dosage de stéroïdes par HPLC

EXERCICE N°4: Evaluation de la fraîcheur du poisson par dosage de l'histamine

EXERCICE N°5: Analyse d'ADN par électrophorèse

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EXERCICE N°1: Analyse de la Lactate déshydrogénase (LDH) par chromatographie d'exclusion

1- La lactate-déshydrogénase (LDH) est une enzyme importante qui catalyse la conversion du pyruvate en lactate et vice-versa. Afin de déterminer la masse moléculaire de cette enzyme, on effectue une chromatographie par exclusion de taille (ou filtration sur gel) sur une série de protéines standards de masse moléculaire connue et sur l’enzyme LDH. Le volume d’élution (Ve) pour chaque protéine est donné dans le tableau ci-dessous.

Q1- Rappelez le principe de la chromatographie d’exclusion. Q2- En définissant le coefficient de partage Kav des protéines standards, tracez la gamme d’étalonnage qui permet d’estimer la masse moléculaire d’une protéine. En déduire la masse moléculaire de la LDH en kDa.

Besoin d'aide

+ d'infos sur lA LDH

EXERCICE N°2: Etude du facteur du récepteur de l'insuline par SDS-PAGE

La régulation de l’homéostasie du glucose représente certainement la fonction principale de l’insuline (peptide de 6 kDa). L’étude de cellules musculaires a permis de mettre en évidence la première étape de la cascade de signaux intracellulaires enclenchés par l’interaction de ce peptide avec un récepteur membranaire IRS-1 (Insulin receptor 1). Deux extraits protéiques issus de cellules cultivées en présence ou en absence d’insuline ont été utilisés pour purifier ce récepteur IRS-1. L’analyse de la purification a été effectuée par une électrophorèse SDS-page (en présence ou non de béta-mercaptoéthanol) suivi d’un western blot.

Q1-proposer un protocole de préparation d'un extrait protéique à partir de cellules musculaires Q2-quel est l’intérêt d’effectuer un Western blot après l'analyse de la purification par une électrophorèse SDS-page ?

Aide

solution

solution

Deux extraits protéiques issus de cellules cultivées en présence ou en absence d’insuline ont été utilisés pour purifier ce récepteur IRS-1. L’analyse de la purification a été effectuée par une électrophorèse SDS-page (en présence ou non de béta-mercaptoéthanol) suivi d’un western blot. L'anticorps utilisé pour cet immunomarquage est polyclonal et reconnait spécifique IRS-1. Le résultat de cette expérience est schématisé ci-dessous.

Q3-Que déduire de la structure du récepteur (justifiez la réponse)? Q4-Comment auriez-vous pu déterminer précisément les tailles des différentes protéines natives ?

Aide

solution

solution

Deux nouvelles analyses par électrophorèses SDS-Page et western blot sont ensuite effectuées avec cette fois un anticorps spécifique de IRS-1 ayant une tyrosine phosphorylée.

Q5-En comparant cette seconde expérience avec la première que pouvez-vous déduire de l’action de l’insuline sur le récepteur ?

solution

Exercice 3: Dosage de stéroïdes par HPLC

Un mélange de quatre stéroïdes est dosé par HPLC sur une colonne de type C18. La phase mobile est constituée d’un mélange méthanol/eau (70 :30). L'élution se fait en mode isocratique. A partir des structures de ces 4 stéroïdes, quel sera l’eur ordre d’élution ?

Info

Réponse

Exercice 4: Evaluation de la fraîcheur du poisson par dosage de l'histamine

L'histamine est le produit de décarboxylation de l'histidine. Elle est responsable de troubles plus ou moins graves avec des symptômes ressemblant à ceux d'une allergie.Le seuil de tolérance chez les sujets sensibles est de 10 mg d'histamine pour 100 g de poisson. On se propose de doser l'histamine par HPLC.

+ info

Exercice 4: Evaluation de la fraîcheur du poisson par dosage de l'histamine

L'histamine est le produit de décarboxylation de l'histidine. Elle est responsable de troubles plus ou moins graves avec des symptômes ressemblant à ceux d'une allergie.Le seuil de tolérance chez les sujets sensibles est de 10 mg d'histamine pour 100 g de poisson. On se propose de doser l'histamine par HPLC.

+ info

1- Comme vous pouvez le voir sur le document 1, la phase stationnaire utilisée pour l'analyse HPLC est une colonne Kromasil® 5 µm, C18, 250 x 4.6 mm. Sur quel principe de séparation est basée cette chromatographie?

Réponse

2- L'élution est réalisée en gradient binaire eau-acétonitrile, le pourcentage d'acétonitrile augmentant en fonction du temps.Le chromatogramme ci-joint donne un profil d'élution obtenu à la suite de l'injection d'un mélange d'amines biogènes dont l'histamine. Connaissant les structures de la cadavérine et de la putrescine, justifier l'ordre d'élution de ces deux amines.

Réponse

3- La préparation des échantillons avant injection nécessite une extraction, une dérivation précolonne des composés par le chlorure de dansyle et la récupération du dérivé dansylé. Quel est l'intérêt de la dansylation des amines biogènes ?

Réponse

4- La méthode de dosage de l'histamine utilise un étalon externe. Calculer la concentration en histamine dans l'échantillon en µg.mL-1

Réponse

AIDE

Calculer ensuite la masse d'histamine en µg.g-1 d'échantillon sachant que la masse volumique de l'échantillon broyé est de 5 g.mL-1.

Réponse

EXERCICE N°5: Analyse d'ADN par électrophorèse

On dispose de trois ADN d’origines différentes : -ADN N°1 de 700 paires de base qui résiste à l’action des exonucléases -ADN N°2 de 700 paires de base qui peut être hydrolysé par des exonucléases -ADN N°3 est un ADN double brin linéaire de forme B de 290 kDa et de longueur 0,300 µm

Q1-De combien de pb est constitué l’ADN N° 3 ? Données utilisables : 1 tour de double hélice de forme B correspond à 10,5 pb et 3,4 nm. 1 Da = 1g/Mol

AIDE

Réponse

Q2- Quelle est la différence entre l’ADN N°1 et 2 ?

Réponse

EXERCICE N°5: Analyse d'ADN par électrophorèse

Les ADN N° 1, 2, 3 sont soumis à une électrophorèse sur gel d’agarose. Le profil de migration est présenté ci-dessous.

Q3- Interpréter ce profil en associant l’ADN correspondant à chaque piste sachant que le marqueur de taille est constitué de fragments linéaires d’ADN double brin.

Réponse

AIDE

Q4- Les deux formes contenues dans le puit 1 peuvent-elles être converties en une seule forme ? A quel niveau migrera-t-elle ? Expliquez votre réponse.

Réponse

ANNALES D'EXAMENS

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Sujet 2022-2023

Vous devez justifier chacune de vos réponses. Durée de l'épreuve 1h30

PURIFICATION DE LA PROTEINE CEREBRALE BA-22

Des travaux récents dans notre laboratoire ont identifié une nouvelle enzyme qui a été dénommée «BA-22». Afin de purifier la protéine, un extrait de tissu cérébral de souris est mixé dans un tampon Tris 40 mM à pH 7,5. Le broyat est centrifugé à 100 000 g et le surnageant est prélevé pour effectuer la purification de la protéine d’intérêt en 2 étapes chromatographiques successives : -une chromatographie échangeuse d’ions suivie d’une chromatographie d’exclusion de taille. A l’issue de ces deux chromatographies, la protéine purifiée est analysée par électrophorèse.

1 - La première étape de purification de la protéine est une chromatographie échangeuse d’ions sur colonne DEAE-cellulose dont le pKA est égal à 8,5. La colonne est préalablement équilibrée avec 2 CV (CV : Column Volume) de tampon Tris 40 mM pH 7,5. La colonne est ensuite lavée avec 3 CV de tampon de lavage (Tris 40 mM pH 7,5, 25mM NaCl). L’élution se fait par un gradient de sel sur 6 CV, le chromatogramme est représenté figure 1. Afin de déterminer dans quelle fraction est éluée BA-22, l’activité de l’enzyme est testée sur l’ensemble des fractions.

Figure 1 : Profil d'élution de la chromatographie échangeuse d'ions (DEAE-cellulose). Le gradient linéaire de NaCl (0.025M - 0,28M) dans le tampon à pH 7,5 est représenté par ----. les ronds noirs représentent la mesure d’absorbance à 280 nm. Les crois représentent l’activité de l’enzyme.

Q1- Expliquez les différentes étapes de cette chromatographie échangeuse d’ions ? -Expliquez l’intérêt d’équilibrer la colonne DEAE-cellulose avec le tampon Tris 40 mM à pH7.5 ?

AIDE

Q2-En analysant le chromatogramme, que peut -on déduire des pHi des protéines contenues dans les pics I, II, III ? Classer les protéines de ces trois pics des plus acides au plus basiques. -En justifiant votre réponse, identifier le pic contenant BA-22.

AIDE

Cette première étape aurait pu être effectuée avec une technique d’électrophorèse capillaire. Q3-Quels sont les deux phénomènes à l’origine de la séparation des molécules dans cette technique ? -Sachant que la paroi interne du capillaire en silice est négative. Définir les notions de mobilité apparente µapp, de mobilité électro-osmotique µeo et de mobilité électrophorétique µe. -Que peut-on dire sur la mobilité qu’aurait eu l’enzyme BA-22 dans cette électrophorèse ?

AIDE

2 – La deuxième étape de purification de la protéine est une chromatographie d’exclusion de taille (Size Exclusion Chromatography) ou gel filtration. Le type de colonne utilisée est une HiLoad™ Superdex™ 75 16/60 (GE Healthcare). La matrice est un gel Dextran-Agarose permettant de séparer les protéines globulaires entre 3 et 70 kDa. La colonne est calibrée avec un mélange de protéines standard de masse moléculaire connue (figure 2). Figure 2 : Profil de calibration de la colonne. MM correspond à la masse moléculaire en kDa Q4- Quel est le principe général d’une chromatographie d’exclusion de taille ?

Q4- Quel est le principe général d’une chromatographie d’exclusion de taille ?

Q5- A partir du profil de calibration de la colonne, déterminez le volume total (Vt) de la colonne et le volume mort (Vo). Que peut-on dire des protéines 4 et 5 ?

AIDE

Les fractions provenant de la chromatographie échangeuse d’ions correspondantes à BA-22 ont été regroupées et injectées sur la colonne d’exclusion de taille. La figure 3 présente le chromatogramme de l’élution de la colonne. Comme dans l’étape précédente, l’ensemble des fractions est testé pour déterminer où se trouve l’activité enzymatique. Q8- Analysez le profil d’élution puis à partir de l’équation de la droite de calibration de la colonne Kav = f(logMM) de la figure 2, déterminez les masses moléculaires des pics a, b et c. Que pouvez-vous déduire de cette expérience ?

AIDE

3 – Les différentes étapes de la purification de la protéine sont analysées par électrophorèse SDS-Page. Les protéines du lysat total, du surnageant de la centrifugation, les fractions prélevées après la chromatographie échangeuse d’ions (F1) et celles du pic b issues de la gel filtration (fraction 2) sont déposées sur gel SDS-PAGE (figure 4).

Figure 4 : Gel SDS-Page coloré au bleu de coomassie des différentes étapes de la purification.MM : marqueurs de taille en kDa. 1 : lysat total 2 : surnageant issu de la centrifugation 3 : fraction F1 issue de la chromatographie échangeuse d’ions 4 : fractions F2 issues de la chromatographie d’exclusion de taille.

Q7-Analyser le profil électrophorétique. Que pouvez-vous en conclure par rapport à vos hypothèses précédentes

AIDE

4- Les résultats de la purification de la protéine BA-22 sont regroupés dans le tableau 1. Q8- Expliquez comment ont été effectués les calculs des rendements et des facteurs de purification reportés dans le tableau 1 ?

AIDE

Q9- Commentez le tableau de la purification de la protéine BA-22 et concluez sur la purification de la protéine.

AIDE