ADNrec

Tecnologia ADN recombinante

Genética y Biología molecular

En la década de 1950 se descubrió que los genes no eran nada más y nada menos que cadenas de nucleótidos. Un descubrimiento que parece tan sencillo desencadenó, sin embargo, el nacimiento de una nueva era: la de la tecnología del ADN recombinante.

La primera molécula de ADN recombinante fue creada por Paul Berg, a comienzos de los 70. Para aquella época, los biólogos moleculares habían aprendido a alterar genes individuales, cortar y pegar pedazos de ADN de diferentes organismos y moverlos de uno a otro.

Cohen(genetista), y Boyer(bioquímico). Cohen estaba interesado en aprender cómo los genes de plásmidos otorgan resistencia a las bacterias y Boyer trabajaba con enzimas de restricción, por lo que decidieron trabajar juntos en la combinación de dos plásmidos resistentes a antibióticos diferentes para crear una bacteria resistente a ambos.

¿Que es la tecnología del ADNrec?

Conjunto de técnicas que permiten aislar un gen de un organismo, para su posterior manipulación e inserción en otro diferente.

De esta manera podemos hacer que un organismo (animal, vegetal, bacteria, hongo) o un virus produzca una proteína que le sea totalmente extraña

El desarrollo de esta tecnología fue posible gracias a varias líneas de investigación: 1) el conocimiento de las enzimas de restricción, 2) la replicación y reparación de ADN, 3) la replicación de virus y plásmidos y 4) la síntesis química de secuencias de nucleótidos.

Enzimas de restricción(ER)

1975: Nathans y Smith descubrieron un tipo de proteínas -las enzimas endonucleasas o enzimas de restricción- que actúan como "tijeras moleculares", cortando la doble cadena de ADN a través del esqueleto de fosfatos sin dañar las bases.

1978 les otorgaron el premio Nobel y dio origen a la ingeniería genética.

ER ¿Que son?

Son endonucleasas es decir enzimas que degradan acidos nucleicos, en particular ADN producidas por las bacterias

¿Por qué ENDO?

son capaces de cortar el enlace fosfodiéster en nucleótidos localizados dentro de la cadena del ácido nucleico

¿Por qué de restricción?

debido a que restringen la permanencia de un ADN exógeno en la célula bacteriana que produce dicha enzima.

¿Que función tienen en las bacterias?

Mecanismo de defensa frente a ADN exógenos (extraño)

¿Cómo se nombran?

EcoRI

E co R I

genero especie cepa nro

Escherichia coli

BamH1

Bacillus amyloliquefaciens H 1

¿Por qué las ER no degradan al ADN bacteriano?

¿?

ya que el ADN bacteriano esta METILADO (CH3)

Metiltransferasas

enzima que transfiere grupos metilo desde S-adenosil-metionina (SAM) a bases específicas

¿Cómo actuan?

cortan ADN de doble cadena cuando reconocen un patrón de secuencia específico

sitio de restricción

ER

Sitio de restricción

Características

• Entre 4 y 6 pb
• secuencias palindromicas

Dábale arroz a la zorra el abad.

tipo de extremos

¿Como cortan?

Tipo de cortes

Escalonado

Recto

sigue

produce

corte recto

extremos romos

produce

corte escalonado

extremos sticky

• cohesivos
• pegajoso
• escalonado

Recombinación

Ligasa

hace las uniones Pdiester

La ADN ligasa puede unir fragmentos romos entre sí. Sin embargo, es más difícil ligar fragmentos romos (la reacción de ligación es menos eficiente y es más probable que falle) porque no hay secuencias sobresalientes de cadena sencilla que sostengan a las moléculas de ADN en su posición.

Fragmentos de restricción

ER2

ER1

Fragmentos de restricción

Ej

ER1

ER2

ER1

700kb

550 kb

250 kb

900kb

¿cuántos fragmentos se generaron?

¿de qué tamaño?

En total=

Tamaño=

Si cortamos con ER1=

Tamaño=

Tamaño=

Si cortamos con ER2=

ER1

ER1

ER1

550 kb

1600( 700+900)

250 kb

550 kb

1600( 700+900)

250 kb

ER2

1500( 250+550)

ER2

900kb

900kb

1500( 250+550)

ER1

ER2

ER1

Kb=

Kb=

ER1/ER2

Kb=

Kb=

mapa de restriccion

Corrida electroforetica

¿Cómo se cuántos fragmentos? ¿y el tamaño?

ADN

ER1

ER2

ADN

ER1

Electroforesis

tiempo, temp

buffer

ADN

ER2

videitos para mirar

Electroforesis

1. Tutorial paso a paso

2. fundamento

2. Fundamento (Khan academy)

Mapa de restriccion

Mapa fisico de un segmento del ADN que muestra los lugares de corte de ER especificos y las distancias

Ejercicio

Un fragmento lineal de ADN de 7 Kb se corta por separado con dos ER y luego con una mezcla de ambas obteniendose los fragmentos indicados a continuación

Huella genética

La prueba del ADN

Patrones de bandas

• cantidad de bandas
• tamaño

Aunque los miembros de una misma especie tienen un alto grado de coincidencia en su ADN, hay unas secuencias de ADN que marcan la diferencia entre los individuos y que presenta una gran VARIABILIDAD, llamado ADN Hipervariable. La gran especificidad de estas secuencias de cada individuo constituye el fundamento de la PRUEBA de ADN

A pesar de que todos los humanos compartimos el 99,9% de nuestro ADN, en el 0.1 % restante existen características únicas, propias de cada individuo, que permiten su identificación de forma inequívoca.

Esta prueba tiene múltiples aplicaciones

• Test de paternidad
• Análisis de ADN fósil
• Identificación de especies
• Estableces relaciones de parentesco evolutivo
• Identificación forense

Huella genetica o fingerprinting

La huella genética es una técnica de laboratorio que se usa para determinar la identidad probable de una persona en función de la secuencia de nucleótidos de determinadas regiones del ADN humano que son únicas en cada persona. La huella genética se usa en diversas situaciones, como investigaciones criminales, con otros fines forenses y en pruebas de paternidad. En esas situaciones, el objetivo es hacer “coincidir” dos huellas genéticas entre sí, por ejemplo, de la muestra de ADN de una persona conocida y la muestra de una persona desconocida.

En algunas localizaciones de nuestro genoma existen unos determinados fragmentos de ADN de distinta longitud, que se repiten uno a continuación de otro o en tándem. El número de repeticiones de estos fragmentos contribuye a que el ADN de cada persona sea único y por tanto, diferenciable del de cualquier otro individuo (salvo en el caso de gemelos monocigóticos). Estos fragmentos repetidos de ADN se denominan de una forma u otra en función de su tamaño: Los más pequeños (que oscilan entre 2 y 5 pares de bases) se denominan microsatélites o STR (por sus siglas inglesas Short Tandem Repeat). Los más grandes (que oscilan entre 6 y 25 pares de bases) se denominan minisatélites o VNTR (por sus siglas inglesas Variable Number of Tandem Repeats). Tanto unos como otros, aparecen en más de mil localizaciones distintas dentro del genoma, generalmente en regiones no codificantes. Debido a que son diferentes en cada individuo y debido a su presencia en distintos puntos del genoma, los microsatélites y los minisatélites son utilizados como marcadores moleculares en varias técnicas del campo de la biología molecular y la genética, entre las que se encuentra la huella genética. La huella genética es, por tanto, el método mediante el cual se analiza el número de repeticiones de microsatélites o minisatélites que presenta cada individuo, lo que permite diferenciarlo e identificarlo a través de su genética.

El ADN para la prueba de ADN puede proceder de sangre, semen, pelos, hueso,etc

¿Cómo?

1. Se extrae ADN

2. Se corta con ER

3. Corrida electroforética

4. Revelar

5.Se comparan los patrones de bandas

¿Quien es?¿Por qué?

A ponernos a prueba

Los miembros de una misma especia comparten el patrón de bandas de ADN. Los paleontólogos han encontradoen el interior de una cueva diferentes huesos mezclados y quieren descartar los que NO son humanos. AL realizar la prueba del ADN se obtuvieron los siguientes patrones de bandas

¿Cuáles de las muestras no contiene ADN humano?

Vectores

como herramienta de clonacion

Un vector es cualquier vehículo, a menudo un virus o un plásmido que se utiliza para transportar una secuencia de ADN a una célula huésped deseada, como parte de un procedimiento de clonación molecular. Dependiendo de la finalidad del procedimiento de la clonación, el vector puede ayudar a multiplicar, aislar, o expresar el inserto de ADN extraño.

Características de un buen vector

Poseen un pequeño tamaño que oscila entre 3,000 y 10,000 pb, que permite que su ADN sea manipulado con facilidad;

tienen un origen de replicación autónoma, de manera que su replicación en la célula ocurre de manera independiente del control directo del cromosoma

generalmente, tienen alto número de copias (de 500 a 700 copias por célula), lo que genera ADN en gran cantidad;

contienen sitios únicos para el corte con varias enzimas de restricción diferentes (entre 10 y 15) que se usan para insertar en esta región (sitio de clonación múltiple) un gen o secuencias de ADN de interés

cuentan con genes que permiten identificar las células que hayan incorporado el vector con la secuencia de ADN exógena, siendo los más utilizados los genes que confieren resistencia a los antibióticos. MARCADORES DE SELECCÍON

Ejemplo de vectores

• Plásmidos
• Bacteriófagos

• Cósmidos
• YACs
• MACs

Naturales

Artificiales

Plásmidos

Pequeña molécula de ADN circular que a menudo se encuentran en bacterias

¿Por qué un plásmido es un buen vector?

Observar el mapa del plásmido y describirlo

¿Reune las características de un buen vector? ¿Por qué?

¿Qué es un plasmido recombinado? ¿como se construye?

Observa la imagen y enumera los pasos

¿y para qué queremos un plásmido recombinado?

¿Qué es clonar?

Clon

Biblioteca genómica

Biblioteca genómica

¿Cómo se construye?

El principio básico de toda biblioteca :

• Preparación de fragmentos representativos
• Preparación del vector apropiado
• Clonado y transformación
• Selección y screening

¿Qué necesitmaos para construir una biblioteca?

Construcción biblioteca

1. Aislar y fragmentar el ADN genómico del organismo a estudiar2. Preparar el plásmido vector El plásmido tiene dos genes de resistencia: · AmpR → resistencia a ampicilina. · TetR → resistencia a tetraciclina. 3. Insertar los fragmentos de ADN en el plásmido · El sitio de corte para insertar está en medio del gen ampR. · Si entra un fragmento, se interrumpe ampR (pierde función). · tetR sigue intacto. 4. Transformar bacterias competentes con el plásmido · No todas las bacterias van a recibir un plásmido.

5. Selección primaria en tetraciclina · Se siembran en una placa con tetraciclina. · Solo crecen: · bacterias con plásmido vacío (ampR intacto + tetR intacto), · bacterias con plásmido recombinante (ampR interrumpido + tetR intacto). · Las que no recibieron plásmido mueren. 6. Réplica en placa con ampicilina · Con un “replicador” (o un vellón de terciopelo) se transfieren las mismas colonias a una nueva placa con ampicilina. Resultado: · Colonias que crecieron en tet pero no crecen en amp → tienen plásmido recombinante (porque ampR fue interrumpido). · Colonias que crecen en ambas → tienen plásmido vacío.

7. Biblioteca genómica La colección final de colonias recombinantes forma la biblioteca genómica. Cada colonia bacteriana contiene un fragmento distinto del genoma. Entre todas juntas representan el genoma completo.

¿Es posible obtener en el laboratorio bacterias competentes?

Sí se tratan con soluciones que contienen altas concentraciones de iones calcio (CaCl2) y se hacen cambios rápidos de temperatura (de 42° a 4°C) de incubación por uno o dos minutos, con ello se modifica la permeabilidad de la membrana, lo que causa que el ADN penetre en la célula. Otro mecanismo para introducir ADN a células bacterianas es mediante electroporación, en el que las células se exponen a breves pulsos eléctricos, del orden de los milisegundos (1 ms=0.001s) de alto voltaje, lo que genera poros en la membrana permitiendo la entrada del ADN a la célula.

Réplica en placa

Biblioteca genómica

¿cómo identificar gen ?

Identificar y seleccionar colonias con el gen de interes

El siguiente paso es seleccionar las colonias de la biblioteca de ADNc en busca de aquellas que contienen el gen que buscas. Esto normalmente comienza a preparar múltiples filtros de réplica Una vez realizado el número requerido de filtros de réplica, se someten a lisis in situ para romper las paredes celulares y las membranas. El resultado es que el contenido celular se libera y el ADN se desnaturaliza (es decir, se vuelve monocatenario). El ADN luego se adhiere al filtro en su lugar (in situ, donde estaban las colonias). El resultado de la lisis in situ es un filtro con tenues trazas de la colonia original (abajo).

A continuación, se utiliza una sonda molecular para identificar el ADN que contiene la secuencia de interés. La sonda es a menudo un oligonucleótido sintético cuya secuencia se infiere a partir de secuencias de aminoácidos conocidas. Estos oligonucleótidos se hacen radiactivos y se colocan en una bolsa con el (los) filtro (s). El ADN de células que contenían plásmidos recombinantes con un ADNc de interés se unirá a la sonda complementaria.

Los filtros se lavan para eliminar la sonda de oligómero radiactivo no unido y luego se colocan sobre una película de rayos X. Después de un periodo de exposición (revelado), se desarrolla la película. Se formarán manchas negras en la película a partir de la exposición radiactiva, creando una autorradiografía del filtro. Las manchas negras en la autoradiografía corresponden a colonias en un filtro que contienen un plásmido recombinante con su secuencia de interes

Una vez que se identifica un clon positivo en la película, la colonia recombinante correspondiente se localiza en la placa original. Esta colonia se cultiva en un cultivo líquido y se aísla el ADN plasmídico.

Biblioteca ANDc

El ADNc es la abreviatura de ADN complementario o copia, es decir, ADN que ha sido sintetizado como complementario al ARNm maduro, representando solo las regiones de codificante o exones. Por lo tanto, la biblioteca de ADNc se refiere a una representación de la mayoría, o todas, las transcripciones de ARNm maduras aisladas de un tipo de célula, o en otras palabras, representativo de todos los genes expresados en una célula dada en un momento dado y un condición dada.

Para clonar solo los genes expresados, primero se debe convertir el ARNm a cDNA mediante el uso de una transcriptasa inversa

Hibridación

En determinadas condiciones de temperatura, pH o concentración salina, las hebras de la doble hélice de ADN se separan. La separación es causada por la ruptura de los puentes de hidrógeno entre las bases complementarias. Al volver a las condiciones iniciales, esos enlaces se reestablecen y las hebras se asocian nuevamente(hibridan)

La reacción de hibridización también ocurre entre hebras de ADN o de ARN de diferente origen y tamaño, siempre que tengan algunas secuencias complementarias.

Teniendo en cuenta lo anterior, entoncen ¿cuando decimos que dos moléculas hibridan? ¿qué moléculas pueden hibridar?

técnicas basadas en la hibirdación molecular

Técnicas de hibridación

En función de esta propiedad (hibridación) se construyen fragmentos monocatenarios de ADN o ARN de secuencia conocida, marcados con sustancias fluorescentes o radiactivas. Estos fragmentos se usan como sondas para reconocer la presencia de una secuencia complementaria en un cromosoma o en una hebra de ADN. En el caso de querer detectar proteína se usan como sondas Ac.

Permiten detectar y aislar moléculas de ADN, ARN o proteínas específicas en una mezcla compleja que contiene numerosas moléculas similares

Se requieren dos elementos básicos: - La presencia de la secuencia diana o “blanco” en un fragmento, generalmente obtenido con enzimas de restricción, de la muestra de ácido nucleico. Un fragmento corto de ácido nucleico, llamado sonda, de secuencia conocida y complementaria a la secuencia diana, marcado de alguna forma que permita su detección (radiactivo, fluorescente, etc.).

Modulación La calidad en la unión de las cadenas de ácidos nucleicos en un proceso de hibridación viene determinada por unos moduladores que imponen una mayor o menor exigencia de perfección o “astringencia” (“stringency”). Complementaridad Cualquier hibridación en la que la complementariedad sea inferior al 70% se considerará como no-homóloga y, por tanto, ocurre en condiciones de baja astringencia (temperatura baja y/o concentración alta de sales).

Temperatura y PH

Alta astringencia (rigor): temp mas altas y Conc sales bajas

Técnicas:

1. Southern blot
2. Northern Blot
3. Western Blot

-Blotting: transferencia de ácidos nucleicos o proteinas desde un gel a una membrana conservando su posición espacial relativa

Southern blot

En 1975, E. M. Southern describió un método para analizar fragmentos de restricción usando sondas de ADN. Una vez separados por electroforesis, los fragmentos son transferidos a una membrana de nylon o de nitrocelulosa. La hibridización de una sonda radioactiva con su secuencia complementar se registra en una placa o film apropiado

Animación

Transferencia a papel o filtro de nitrocelulosa(Blotting)

Northern Blot

Técnica que se utiliza para detectar una secuencia de ARN específica dentro de una mezcla compleja de ARNs

Pasos

1. Aislamiento de RNA 2. Separar por electroforesis cond. desnaturalizante (formaldehido) 3. Transferir a membrana de nitrocelulosa o nylon 4. Hibridar con sondade ADN específica 5. Lavar 6. Revelar

Western Blot

Técnica que permite identificar la presencia de proteínas específicas en una muestra separados electroforéticamente con anticuerpos.

Pasos

1. Aislamiento las proteínas 2. Separar por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE-SDS) 3. Transferir a membrana de nitrocelulosa o nylon 4. Hibridar con sonda específica (Anticuerpos) 5. Lavar 5 . Revelar

PCR

Reaccion en Cadena de la Polimerasa

Objetivo: Técnica que permite hacer muchas copias (millones )de una determinada región de ADN in vitro.

Por lo general, el objetivo de la PCR es producir suficiente ADN de la región blanco para que pueda analizarse o usarse de alguna otra manera. Por ejemplo, el ADN amplificado por PCR se puede secuenciar, visualizar por electroforesis en gel o clonar en un plásmido para otros experimentos.

Lee acá sobre la técnica : Khan Academy

¿Qué se necesita para hacer PCR?

1. ADN molde: el ADN original que queremos copiar. 2.Primers: pequeños fragmentos de ADN que indican dónde empezar a copiar. 2 Primers (Forward y reverse) 3. ADN polimerasa: una enzima que sintetiza nuevas hebras de ADN. En PCR se usa una especial llamada Taq polimerasa, que resiste el calor. 4. Nucleótidos libres (dNTPs): los “ladrillos” que usa la polimerasa para construir nuevas hebras. 5. Buffer: una solución que mantiene las condiciones químicas adecuadas. 6. Mg: cofactor de la Taq polimerasa

Entrá a esta pagina para mas información

Taq polimerasa

La ADN polimerasa que normalmente se utiliza en la PCR se llama Taq polimerasa, por la bacteria resistente al calor de la que se aisló (Thermus aquaticus , bacteria termofila).

es muy termoestable y su mayor actividad se presenta cerca de los 70

Primer o cebadores

En una reacción de PCR, la región de ADN que será amplificada, se determina por los primers que el investigador elija.

Primers

Qué se debe tener en cuenta al diseñarlos

1. Secuencia complementaria: Cada primer debe ser complementario a una de las hebras del ADN molde, en los extremos del fragmento que se quiere copiar. → Uno se une a la hebra “forward” y el otro a la “reverse”. 2. Dirección de síntesis: La polimerasa solo copia en dirección 5’ → 3’, por eso los primers se orientan uno en cada hebra, apuntando hacia el interior del fragmento a amplificar. 3. Temperatura de amealing: Deben tener una composición de bases equilibrada (cantidad similar de G/C y A/T), para que ambos se unan al ADN a temperaturas parecidas (generalmente 50–60 °C). 4. Especificidad: El primer debe ajustar solo en un lugar del genoma, no en secuencias parecidas . → Esto asegura que la PCR sea precisa. 5. Longitud y contenido de GC: Ni muy cortos (serían inespecíficos), ni muy largos (no se unirían bien). → Entre 18–25 bases y 40–60 % de G+C suele funcionar bien.

Taq polimerasa, dNTPs, Mg, Buffer, agua, ADN molde

Pasos de cada ciclo

35-40 ciclos

1. Desnaturalización (96 °): la reacción se calienta bastante para separar, o desnaturalizar, las cadenas de ADN. Esto proporciona los moldes de cadena sencilla para el siguiente paso. 2. Annealing (55 - 65°): la reacción se enfría para que los primers puedan unirse a sus secuencias complementarias en el molde de ADN de cadena sencilla. 3. Polimerización (72 °): la temperatura de la reacción se eleva para que la Taq polimerasa extienda los primers y sintetice así nuevas cadenas de ADN.

¿Por qué se hace una electroforesis después de una PCR?

La PCR te permite amplificar un fragmento de ADN. Pero la máquina (el termociclador) no te “muestra” nada visible: al final del proceso, solo hay un tubo con ADN invisible al ojo humano. Entonces, necesitamos una forma de comprobar si se amplificó algo, y si tiene el tamaño esperado. Ahí entra la electroforesis en gel de agarosa.

¿Qué se observa?

Una banda en el lugar esperado: indica que la PCR funcionó y que ese fragmento (o gen) está presente.Ninguna banda: puede significar que el gen no está o que la PCR falló. Varias bandas: puede indicar problemas de especificidad (primers mal diseñados o contaminación).

Video PCR

Secuenciación del ADN

¿Qué es secuenciar?

Determinar el orden de los 4 nucleótidos en un fragmento de a ácido nucleico

Aunque originalmente existían otros métodos, no fue hasta 1977 cuando Sanger y otros colaboradores establecieron la estrategia que sería utilizada durante más de 2 décadas, y todavía en uso para ciertos casos, para cumplir con este objetivo.

Secuenciación de Sanger

Metodo de terminación de cadena

Esta estrategia se basa en sintetizar, de forma secuencial, una cadena de ADN complementaria a una hebra de cadena simple (que se utiliza como molde), en presencia de ADN polimerasa, los cuatro dNTPS del ADN (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) y cuatro dideoxinucleótidos (ddATP, ddGTP, ddCTP y ddTTP)

LA clave esta en los ddTNPs o nucleótidos de terminación , están diseñados para que carezcan del grupo 3’-OH, que permite la adición del nucleótido consecutivo, de forma que cuando uno de ellos es incorporado por la polimerasa se interrumpe la síntesis de la nueva hebra. Esto lleva a que se obtengan fragmentos secuenciados de diferente tamaño, según dónde se incorporen los dideoxinucleótidos. De este modo, y tras una simple electroforesis, se va a poder dilucidar la secuencia.

no puede generarse la union Pdiester entre un nucleótido y el otro en un cadena

ADN a secuenciar

ATTCGACATTGGCAGTA

En primer lugar, se llevan a cabo cuatro reacciones distintas en tubos diferentes.

ADN molde

ADN molde

ADN molde

ADN molde

dATP dTTP dCTP dGTP

dATP dTTP dCTP dGTP

dATP dTTP dCTP dGTP

dATP dTTP dCTP dGTP

ddATP

ddTTP

ddCTP

ddGTP

primer

primer

primer

primer

La ADN polimerasa va añadiendo dNTPs hasta que de forma aleatoria, incorpora el ddNTP, por ejemplo el ddATP (cada uno de los tubos contiene un ddNTP distinto) y se interrumpe la síntesis. De esta forma, en el tubo van a aparecer fragmentos secuenciados de diferentes tamaños e interrumpidos por el ddNTP del mismo tipo (en este caso ddATP).

A continuación, el contenido de cada uno de los tubos se corre en carreras diferentes de un gel de acrilamida. Finalmente, tras separar en función del tamaño, y gracias al cebador marcado radiactivamente, se van a poder contemplar diferentes bandas que van a poder ser traducidas en diferentes nucleótidos.

Por ejemplo en el primer tubo donde esta el ddATP

ATTCGACATTGGCAGTA

TA (2)

TAA (3)

TAAGCTGTA (9)

TAAGCTGTAA (10)

TAAGCTGTAACCGTCA (16)

Por ejemplo en el primer tubo donde esta el ddTTP

ATTCGACATTGGCAGTA