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q-LAMP

Marina Corral Ibáñez

Created on March 3, 2020

La "loop mediated isothermal amplification" es otra técnica de amplificación de ácidos nucleicos alternativa a la q-PCR y más desconocida entre los alumnos del sector bioquímico. En este póster se presentan sus principales características, que es necesario para que se produzca la reacci´n y cuál es el fundamento de esa reacción.

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Transcript

q-LAMP

(quantitative loop-mediated isothermal amplification)

Bibliografía

¿Qué es LAMP?

Fundamento

El proceso comienza con la hibridación del cebador interno fordward y con la elongación del resto del amplicón, separando las dos hebras. Ahora, el cebador externo fordward se hibrida y se sintetiza otra hebra. Conforme se forma esta nueva,la molécula resultante del cebador interno se cicla (al tener una región complementaria a una zona del amplicón). El proceso ahora se repite pero con los cebadores backward. De ello, resulta una molécula con estructura de pesa LAMP, la cual posee múltiples zona de inicio de replicación (desde los extremos 3' o desde los primers de los bucles, permitiendo la síntesis y elongación de múltiples moléculas bicatenarias a las que se puede asociar un fluoróforo y cuantificarlas.

Otras maneras de amplificar

Es un método de amplificación isotermal diseñado para detectar secuencias diana de ADN sin necesidad de equipamiento sofisticado. Tiene una alta sensibilidad pero con resultado rápido (5-10 minutos de reacción). La reacción se puede realizar con recursos limitados usando baño de agua y detección del resultado a simple vista por turbidez o una detección a tiempo real (q-LAMP) con fluorímetros o la maquinaria habitual usada para medición en q-PCR.

La qPCR no es el único método que se puede utilizar para amplificar y cuantificar manterial genético. Nuevas técnicas como LAMP han surgido en los últimos años aunque ambas son muy parecidos.

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+RESULTADOS

PASOS A SEGUIR

Materiales requeridos para la MIX de LAMP

(protocolo de Yan et al como ejemplo)

(protocolo de Yan et al optimizado)

  • Obtención de las colonias de estudio y asegurar su mantenimiento
  • Extracción de ADN genómico
  • Diseño de primers y preparación del equipamiento necesario
  • Preparación de la mix
  • Dejar que ocurra la reacción durante 1h a 65ºC
  • Ver/Cuantificar resultados
  • Optimizar la reacción

Para 25μl de mix:

  • 2.5 μl de 10x Thermopol buffer
  • 2 μl dNTPs mM
  • 2 μl MgSO4 100mM
  • 5 μl de betaina
  • 7.5 μl de ddH2O
  • 1 μl de cada primer (F3, B3, FIP y BIP)
  • 1 μl de polimerasa Bst
  • 1 μl de ADN muestra

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