colorazione gram

Assia Belkacem 3BLSSA

La colorazione differenziale

Colorazione di gram positivi e negativi

La colorazione differenziale permette di suddividere i batteri in gruppi distinti in base al tipo di reazione che manifestano se sottoposti a colorazione. Questa differenziazione è dovuta alla diversa composizione cellulare dei diversi generi di batteri.

La colorazione di Gram

Differenziazione tra Gram positivi e negativi

Gram negativi

Gram positivi

1. Parete cellulare più complessa.

1. Spessa parete cellulare formata da uno strato di peptidoglicano posto al di fuori della membrana citoplasmatica

2. Sottile strato di peptidoglicano.

VS

3. la membrana esterna è situata al di fuori del sottile strato di peptidoglicano.

2. La parete cellulare trattiene all’interno della cellula batterica la colorazione iniziale.

4. La parete cellulare non è in grado di trattenere la colorazione iniziale dopo l’aggiunta di un liquido decolorante.

OBIETTIVO

Classificare i batteri in Gram+ o Gram- con la color. di Gram

MATERIALE OCCORRENTE

Materiale chimico

Attrezzature

Materiale biochimico

•Violetto di Nicol

•Coltura in piastra di batteri

•Vetrino portaoggetti

•Safranina

•Pinza da laboratorio

•Soluzione di Lugol

•Pipetta monouso

•Alcool

•Bacinella per colorazioni con supporto di vetro

•Spruzzetta con acqua distillata

•Fiamma Bunsen

•Ansa sterile

•Microscopio

Procedimento

1. Distensione della coltura

5. Mordenzatura

6. Decolorazione

2. Essiccamento della coltura

7. Colorazione di contrasto

3. Fissazione della coltura

8. Osservazione microscopica

4. Colorazione iniziale

DISTENSIONE DELLA COLTURA

Prelevare con un'ansa e con tecnica sterile una goccia del brodo di coltura del microrganismo in esame e depositarla strisciando sul vetrino portaoggetto in modo da formare uno strato sottile ed uniforme.

ESSICCAMENTO DELLA COLTURA

Reggere il vetrino in una zona non strisciata con la coltura con pinze di legno. Tenere il vetrino vicino alla fiamma (ma non sopra) fino a far evaporare tutto il liquido.

COLORAZIONE INIZIALE

Appoggiare il vetrino sul supporto di vetro della bacinella per colorazioni. Coprire il vetrino con il preparato con Violetto di Nicol e lasciare a contatto per 3 minuti. Scolare l’eccesso di colorante.

MORDENZATURA

Coprire il vetrino con la soluzione di Lugol e lasciare a contatto per 1 minuto. Scolare l’eccesso di Lugol.

DECOLORAZIONE

Lavare il vetrino con l'Alcool etilico fino a completa decolorazione del preparato. Scolare l’eccesso di decolorante e lavare il vetrino con la spruzzetta di acqua dist. fino a che questa non scende incolore.

COLORAZIONE DI CONTRASTO

Coprire il vetrino con Safranina e lasciare a contatto per 1 minuto.

Scolare l’eccesso di colorante e lavare il vetrino con la spruzzetta di acqua dist. fino a che questo non scende incolore. Asciugare il vetrino dall'acqua vicino alla fiamma bunsen.

OSSERVAZIONE MICROSCOPICA

Aggiungere qualche goccia d'olio. Coprire il vetrino con il coprioggetto, cercando di non inglobare aria.Osservare al microscopio.

Osservazioni e conclusione

Gram NEGATIVI

I batteri che assorbono il primo colorante non vengono decolorati; quelli che invece non assorbono il primo colorante trattengono il secondo colorante.I batteri che ho analizzato al microscopio sono risultati negativi in quanto assumono la colorazione rosea.

Gram POSITIVI

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